Развитие каллуса у имплантантов картофеля и топинамбура

Каллус (= каллюс) – защитная ткань растительного организма, способствующая зарастанию ран, срастанию прививок, образованию корней при вегетативном размножении и т.д. Он возникает из недифференцированных клеток в случае повреждения поверхности (надрезы, трещины, срезы черенков и др.) из клеток любого органа растения. Каллус способен расти самостоятельно при культивировании на искусственных питательных средах. Он имеет форму валика или аморфной бесформенной массы. Наиболее активно каллус разрастается, когда в раневой поверхности есть камбий. У споровых растений каллус возникает редко.

Ведущую роль в образовании каллуса играют ауксины. Они индуцируют или стимулируют деление, растяжение или углубляют дифференциацию клеток, способствуют образованию каллуса и опухолей, рост плодов и образование корней, задерживают опадание листьев и цветков.

У клубней картофеля в ответ на раневое поражение, области деления клеток распределяются случайным образом.

Удаление клетки из системы растительного организма и культивирование её in vitro позволяет открыть её потенциальные возможности, заложенные в генетическом аппарате. Освободившись от контактного влияния, клетки начинают делиться, создавая каллус и в дальнейшем переходя к формированию дифференцированных структур (почка и первичный корешок), что приводит к регенерации растительного организма с соблюдением всех стадий онтогенеза (Нефели В. И., 1984). Это явление наблюдали при культивировании паренхимы табака. В каллусной ткани заложение почек индуцируется гормонами, в частности, цитокинином. Регенерация растения из трансформированных недифференцированных тканей, в том числе и их каллусов осуществляется с трудом.

У картофеля склонность к каллусогенезу проявляется при культивировании апикальной меристемы на искусственных питательных средах (ИПС) с включением альфа НУК и увеличивалась пропорционально повышению концентрации этого вещества. В большинстве случаев рост каллуса предшествует появлению ростка. Наиболее благоприятное, многократно проверенное сочетание компонентов, позволяет получать оздоровленные от вирусов проростки. Размер проростков около 2 5 мм. Время роста – 1-2 месяца. Среда включает 0.02 кинетина 0.04 – 0.08 мг/л, ИУК – 1 – 2 (или ИМК 0.1 – 0.2), феруловой кислоты 0.02 – 0.04 мг/л. При таком сочетании компонентов среды, появлению проростка предшествует образование каллусной ткани, что несколько затягивает морфообразовательные процессы, но повышает вероятность полного освобождения меристемного растения от вирусов (Л. Н. Трофимец, 1975; Б. А. Писарев, Л. Н. Трофимец, 1983) В 1983 году Н. В. Донец предложил новое сочетание регуляторов роста растений, при котором начальный, листовой морфогенез проходит в отсутствии каллусной ткани у основания проростка. Из среды исключают ауксин, вводят предельно допустимую дозу кинетина (0.5 мг/л), добавляют повышенную дозу аденина (40 мг/л), обладающую цитокининовой активностью.

Изучение каллусных и меристемных линий растений картофеля в вегетационных и полевых условиях не выявило чётких морфологических отклонений у различных сортов картофеля. В некоторых случаях были отмечены некоторые морфологические отклонения (водянистые и утолщённые стебли и листья, хлоротичная окраска и др.). Такие регенеранты или быстро погибают или такие отклонения исчезали при последующем размножении in vitro.

Каллус можно использовать при решении вопросов вегетативной (соматической) гибридизации. С этой целью получают культуры каллуса, выделенные из различных органов картофеля (корни, стебли, листья, апикальная меристема, точки роста и т. д.), в зависимости от цели, после чего такие имплантанты переносят на ИПС с индукторами каллусогенеза (добавки в среду Мурасиге-Скуга – кинетин 1 мг/л + 2-4-Д – 2 мг/л). Инкубирование проводят в темноте при температуре +25оС. Каллусную ткань в количестве, достаточном для пересадки на новую среду обычно получают в течение 5 – 8 недель. После ряда пассажей из рыхлого каллуса получают суспензию, которую готовят путём переноса кусочков рыхлого каллуса в жидкую среду аналогичного состава и перемешивают с помощью круговой качалки. Крупные агрегаты каллуса отстаивают, а затем клетки из верхнего слоя переносят на свежую среду. Для получения клеточных суспензий, минуя каллус, используют специализированные среды, мацерирующие ткани, с добавлением соответствующих ферментов (Л. Н. Трофимец), 1989/.

Сходные явления (образование онкогенных растительных клеток) вызывают агробактерии - бактерии из рода Agrobacterium – Agrobacterium rhizogenes и Agrobacterium tumefaciens. Эти же бактерии способны регулировать процессы образования естественнообразующегося каллюса. Однако получить морфологически и физиологически нормальные регенерационные растения из онкогенных клеток пока не удавалось. На участках поражения двудольных растений агробактерии вызывают заболевание "корончатые галлы" и "косматые корни". Только амариллисовые (Amaryllidaceae) и лилейные (Liliaceae) растения слабо поражаются агробактериями. Однажды начавшая развиваться опухоль может продолжать развитие и в отсутствии бактерий. Опухолевые ткани растений могут расти в культурах на питательных средах в отсутствии экзогенных ауксинов и цитокининов (Д. Дрейпер и др., 1991).

Для выявления особенностей развития каллусов у картофеля и топинамбура мы использовали в качестве имплантантов вычлененные корневые шейки, ломтики клубней, почечные срезы ростков с зачатками ростков, корней и столонов, а также кружки, вырезанные из листьев картофеля и топинамбура, диаметром 30 – 40 мм для обоих видов и ягоды картофеля, разрезанные пополам. Опыты проводили в чашках Петри при температуре + 18 – 22оС и стопроцентной относительной влажности воздуха. Каллусообразование стимулиовали 0.001%-ным раствором морской соли. Фрагменты растений раскладывали на стерильную почву, которой покрывали дно чашек. Как показали исследования, активное каллусообразование начиналось уже на третий день опыта. Наиболее активно каллус в виде светло-коричневой гелеобразной массы развивался у корневых шеек, на восьмой день опыта каллус опустился вниз по стеблю и распространился по почве. У ломтиков клубней каллус сначала валиком по периферии клубня а затем распространился по всей поверхности. Каллусообразование на срезах столонов шло довольно активно, и сползающая на землю ткань распространялась вокруг среза. Отделённый от импланта слой каллуса продолжал некоторое время развиваться на почве, занимая новые пространства. У разрезанных ягод каллюс образовывался по периферии постепенно распространяясь вглубь. У топинамбура образование каллуса шло менее активно чем у картофеля. Наиболее быстро каллус распространялся по раневой поверхности ломтиков клубней и срезах ростков. Кружки из листьев изучаемых растений каллус практически не образовывали.

Таким образом, показана возможность получения значительных количеств каллусной ткани на раневых поверхностях, и распространение их по почвенному субстрату в присутствии 0.001% раствора морской соли, что может оказаться полезным при подборе составов питательных сред при культивирования аморфных каллусных тканей и использовании каллуса как естественную питательную среду при культивировании бактерий.

Литература

1. Дрейпер Д.С., Армитидж Ф., Дьюри Г. Джэкоб Л. Уолден Р., Кумар А. Джефферсон Р., Хэмил Д. Генная инженерия растений. Издательство Мир. 1991. 420 стр.

2. Нефели В.И. Рассказы о фитогормонах. М. Агропромиздат. 1985. 148 стр.

3. Писарев Б.А., Трофимец Л.Н. Семеноводство картофеля. – М.: Россельхозиздат. 1982. 238 стр.

4. Трофимец Л.Н. Биотехнология в картофелеводстве. М. 1989. 48 стр.

Абашкин О. В., Бойко Ю. П., Подобедов В. И., Масюк Ю. А., Алексютина О. А., Абросимов Д. В. Зейрук В. Н., Овэс Е. В.

ГНУ ВНИИКХ им. А. Г. Лорха.